1. Objetivo final da técnica histológica

O objetivo final é levar ao microscópio ótico (m.o.) uma amostra em que:

• Os tecidos estão preservados.
• Mantêm a mesma arquitetura que apresentavam in vivo.
• Mantêm, tanto quanto possível, a mesma composição química in vivo.

Quando a imagem não é equivalente à real → trata-se de um artefacto, exigindo interpretação cuidadosa.

2. Fixação – conceito geral

• A fixação é a primeira fase do processamento histológico.
• É uma fase de preparação para as etapas seguintes (desidratação, diafanização, inclusão).
• Envolve uma série complexa de eventos químicos, diferente para cada tipo de substância presente nos tecidos.

Função-chave:

Interromper a degradação orgânica (vida → morte → decomposição), de modo a:

• Prevenir autólise e putrefação.
• Conservar arquitetura e composição tecidular.
• Garantir que a imagem histológica é equivalente à real.

Tecidos mais sensíveis:

• Tecidos ricos em enzimas → fígado, rins, cérebro, pâncreas, etc.

3. Fenómenos de degradação pós-morte

3.1. Definição de morte

• Nível metabólico a partir do qual as células não conseguem recuperar as funções vitais.

3.2. Autólise

• Autodigestão enzimática celular, após a morte.
• Envolve rutura da membrana dos lisossomas e saída das enzimas para o citoplasma.

Aspeto microscópico (M.O.):

• Citoplasma tumefeito, com aspeto de massa granular homogénea.
• Citoplasma incapaz de ser corado (“washed-out”).
• Difusão de substâncias intracelulares importantes (ex.: glicogénio).
• Separação (“descamação”) entre epitélio e membrana basal.

3.3. Putrefação

• Degradação dos tecidos por toxinas e enzimas bacterianas.
• Bactérias geralmente saprófitas.
• Complementa o efeito da autólise até destruição celular completa.

3.4. Fatores que influenciam autólise e putrefação

• Localização e natureza do tecido:
• Tecidos com muitas enzimas digestivas → ex.: pâncreas.
• Tecidos com grande quantidade de microrganismos → ex.: intestino.
• Temperatura:
• Quanto maior a temperatura ambiente, maior a velocidade de autólise e putrefação.
• Temperatura ótima para atividade enzimática e bacteriana: 37–42 ºC.

4. Objetivos da fixação tecidular

A fixação tem como objetivos principais:

1. Prevenir a autólise (inativar enzimas celulares).
2. Prevenir a contaminação bacteriana (efeito microbicida).
3. Evitar alterações de forma e volume durante o processamento (retrações, distorções).
4. Permitir coloração adequada dos cortes histológicos.
5. Manter os tecidos o mais semelhante possível ao estado “in vivo”, sem perdas ou rearranjos importantes dos seus componentes (incluindo lípidos – exigem precauções especiais).

É sempre um compromisso: fixar bem, mas sem alterar demasiado a morfologia.

5. Princípios gerais da fixação

1. Não existe método universal de fixação

• Um fixador adequado para um tecido pode não ser para outro.

1. Fixação ≠ conservação tecidular eterna

• Nem todos os fixadores conservam o tecido indefinidamente.
• O formol é, além de fixador, também um bom conservante.

1. Defeitos de fixação dificilmente são corrigidos

• Uma má fixação acompanha todo o processo.

1. Graves defeitos na fixação podem inviabilizar o estudo histológico
2. → comprometem o diagnóstico.

6. Fixação tecidular – componente proteico

• As proteínas estruturais, quando fixadas, tornam-se insolúveis, conferindo:
• Consistência mecânica ao tecido.
• Condições para suportar o processamento seguinte (desidratação, corte, etc.).
• A microanatomia dos tecidos mantém-se, permitindo o diagnóstico histopatológico.

7. Classificação da fixação – mecanismos de atuação

7.1. Fixação física

Objetivo: deter autólise e putrefação sem reagentes químicos, através de alterações físicas.

• Calor
• Congelação
• Micro-ondas

Congelação

• Ideal para estudos morfológicos e funcionais, porque preserva:
• Estrutura antigénica
• Atividade enzimática
• Deve ser instantânea para evitar formação de microcristais de gelo intracelular (que destroem a estrutura).
• Métodos:
• Azoto líquido
• Usado para biópsias e material para extração de DNA.
• Não é o mais adequado para cortes histológicos de rotina.
• Isopentano a -50 ºC
• Fragmentos até cerca de 3 cm² / 3 mm de espessura
• Congelação muito rápida (~10 segundos).
• Conservação em arcas a –70 ºC.

7.2. Fixação química

Objetivo: desnaturar e insolubilizar proteínas tecidulares, bloqueando:

• Autólise (por inativação enzimática).
• Crescimento bacteriano.

Características fundamentais de um bom fixador químico:

1. Capacidade de bloquear de imediato a autólise (rápida desnaturação proteica).
2. Efeito microbicida eficaz.
3. Evitar retrações e distorções que alterem a arquitetura.
4. Provocar alterações que favoreçam inclusão, corte e coloração.

8. Regras gerais para utilização de fixadores líquidos

• Colocar o tecido no líquido fixador o mais rapidamente possível após a colheita.
• Fragmentos de tecido com cerca de 2–3 mm, para permitir rápida difusão.
• Volume do fixador: cerca de 10 vezes o volume do fragmento.
• Pressão osmótica do fixador ≈ do tecido (geralmente com soluções salinas equilibradas).
• pH do fixador deve aproximar-se do pH fisiológico (neutro), exceto quando se usam fixadores ácidos específicos.
• Tempo de fixação é específico para cada fixador; o tempo máximo não deve ser ultrapassado.

9. Fixadores químicos em Anatomia Patológica – aldeídos

9.1. Formaldeído (formol 10% tamponado)

• Fixador mais utilizado na histologia convencional de microscopia ótica (parafina, coloração H&E).
• Fixador mais barato e amplamente disponível.
• Único fixador que proporciona conservação tecidular adequada a longo prazo.
• Não endurece excessivamente os tecidos → bom para armazenar biópsias e peças cirúrgicas.
• Provoca retracção tecidular reduzida.
• Velocidade de penetração intermédia: cerca de 1 mm/hora → adequado para peças cirúrgicas.
• Fixador adequado para tecido adiposo e lípidos em geral.
• Compatível com a maioria das colorações de rotina e especiais.

Influência da temperatura:

• A velocidade de fixação por formol pode ser:
• Atrasada ou
• Acelerada
• pela temperatura (mais quente → mais rápida, mas com maior risco de artefactos).

Tempo de fixação completo a temperatura ambiente (RT):

• Aproximadamente 36 horas.

Importância imunohistoquímica:

• A fixação em formol 10% tamponado faz-se através de ligações cruzadas entre proteínas, mantendo os constituintes celulares nas suas relações “in vivo”.
• A antigenicidade não se perde completamente, o que é essencial para:
• Métodos imunoenzimáticos
• Imunofluorescência

Desvantagens do formaldeído

• Irritação severa da pele e dos olhos.
• Sensibilização por contacto respiratório e cutâneo.
• Necessidade de:
• Monitorização periódica dos níveis de exposição.
• Ventilação e exaustão adequadas.
• Sistema de esgoto adequado ou soluções comerciais para eliminação segura.
• Pode promover aparecimento de pigmentos formólicos (artefactos de fixação).

10. Artefactos de fixação

Definição:

• Imagens que não são equivalentes à realidade e são induzidas ao longo do processamento histológico, repetindo-se em preparações diferentes.

Principais tipos:

1. Rupturas
2. Retracções tecidulares

• Provocadas por graus diferentes de retração dentro do mesmo fragmento ao ser exposto ao fixador.
• Devidas, em grande parte, às diferenças de proporção de água existentes entre tecidos.
• Também relacionadas com diferenças de pressão osmótica entre o fixador e o tecido.

1. Pigmentos formólicos

• Depósitos pigmentados, geralmente castanhos, resultantes da ação do formol em determinadas condições.

1. Artefactos mecânicos e de superfície (visíveis nas imagens da apresentação):

• “Split artifact”: fendas ou separação de camadas (ex.: intestino).
• Pigmentação de superfície por reagentes (ex.: marcação de margens com nitrato de prata, tinta da china).
• Riscos (scratch lines) causados por faca danificada.
• Dobras, pregas ou cortes rasgados por má extensão.
• Contaminação por tecido de outro doente (fragmentos estranhos na lâmina).

Saber reconhecer artefactos é importante para não os confundir com lesões patológicas verdadeiras.

11. Descalcificação

• Tecido com depósitos de cálcio (por exemplo osso) não pode ser cortado em bloco de parafina antes de remover o cálcio.

11.1. Métodos

• A técnica mais comum é a utilização de ácidos, por exemplo:
• Ácido nítrico
• → Remove rapidamente grandes quantidades de cálcio.
• Tecidos mais frágeis (ex.: medula óssea) devem ser descalcificados com:
• Líquido de Bouin, que atua simultaneamente como fixador e descalcificador, sendo mais suave.

12. Processamento histológico de tecidos

Objetivo geral:

• Elaborar cortes histológicos finos para observação microscópica.
• Os tecidos são impregnados em parafina, com densidade semelhante à do tecido, permitindo cortes de rotina com espessura de 3 µm.

12.1. Etapas principais

1. Desidratação

• Remoção gradual da água dos tecidos.
• Feita com uma série crescente de álcoois:
• 70% → 95% → 100%.

1. Clarificação / diafanização

• Substituição do álcool por um solvente miscível com parafina, normalmente xilol, que torna o tecido translúcido.

1. Impregnação

• O tecido é embebido no agente impregnante → parafina.
• Parafina utilizada geralmente com ponto de fusão 58–60 ºC.

12.2. Processadores de tecidos

• O processamento pode ser:
• Manual (em séries de cubas).
• Automático (processadores de tecidos: programam todos os passos).

Consequências de processamento inadequado:

• Área central esbranquiçada e insuficientemente endurecida no bloco:
• Possíveis causas:
• Tecido insuficientemente desidratado ou diafanizado.
• Impregnação com parafina insuficiente.
• Consequência: o bloco não poderá ser cortado corretamente.

13. Inclusão em parafina

Depois da impregnação:

• Os fragmentos são incluídos em moldes com parafina, formando blocos de parafina.

13.1. Aparelho de inclusão

• Possui:
• Zona de parafina líquida.
• Moldes.
• Zona aquecida para orientar o fragmento.
• Superfícies frias para solidificação rápida.

13.2. Orientação dos fragmentos – princípios gerais

• Os fragmentos impregnados devem ser incluídos em posição adequada ao tipo de corte desejado.
• Ter em conta que a parte inferior do bloco será a superfície de corte.
• A posição ideal deve ser determinada antes do processamento, podendo marcar-se a superfície oposta com tinta da china.
• O fragmento deve ser incluído ao mesmo nível, para garantir corte completo.
• Usa-se pinça para o pressionar contra a superfície do molde (com cuidado para não danificar o tecido).

13.3. Regras específicas de orientação

• Parte menos dura e mais pequena do tecido deve ser cortada em primeiro lugar
• → evita compressão dos tecidos duros sobre os brandos, reduzindo rugas.
• Deve haver uma margem de parafina à volta de todo o fragmento, para melhor suporte no bloco e durante o corte.

Estruturas tubulares

• Ex.: artérias, veias, canais deferentes, trompas de Falópio.
• Devem ser incluídas verticalmente, de modo que o corte atravesse toda a parede.

Tecidos com superfície epitelial

• Ex.: pele, intestino, bexiga, útero.
• Devem ser colocados de forma que o plano de corte atravesse todas as camadas e a superfície epitelial seja cortada por último (no topo), para:
• Minimizar a pressão e distorção na camada epitelial.

Múltiplos fragmentos epiteliais

• Devem ser incluídos lado a lado, com a mesma orientação da superfície epitelial.
• Podem ser marcados com tinta da china ou eosina alcoólica para identificação de margens.

Vários fragmentos em geral

• Devem ser incluídos lado a lado, com espaço entre eles, facilitando:
• Observação.
• Organização da lâmina.

Fragmentos pequenos retangulares

• Devem ser orientados de forma que o eixo mais longo fique perpendicular à faca:
• Minimiza distorção e enrugamento.

Estruturas císticas

• Devem ser incluídas de modo que a superfície de corte fique para baixo, para que o corte atravesse todas as camadas da parede cística.

Conclusão: os fragmentos devem ser alinhados e corretamente orientados no bloco – isto é fundamental para a qualidade dos cortes.

14. Microtomia – secções histológicas

• Com o micrótomo, os blocos são cortados em secções finas, normalmente de 3 µm.

14.1. Etapas da microtomia

1. Desbaste do bloco

• Retira o excesso de parafina até expor o tecido.

1. Corte histológico

• Produção de fitas de secções com espessura uniforme.

1. Extensão

• Colocação das secções numa tina com água fria para eliminar pregas.
• Depois, transferência para água morna (banho de água) para melhor extensão.

1. Secagem

• As secções estendidas na lâmina são colocadas em estufa a ~60ºC, cerca de 20 minutos, para:
• Derreter a parafina residual.
• Promover melhor aderência do tecido à lâmina.

14.2. Procedimentos complementares

• Identificação da lâmina com o número histológico.
• Limpeza do banho de água para evitar:
• Contaminação entre casos.
• Inclusão de fragmentos estranhos.

14.3. Artefactos associados à microtomia

• Faca danificada → riscos no tecido.
• Má extensão → dobras, cortes enrugados, descolamento de tecido.
• Desidratação ou fixação incorreta → cortes quebradiços, rasgados.
• Contaminação de lâminas com tecido de outro doente.

15. Cortes de congelação

• Usados para diagnóstico rápido (extemporâneo, intraoperatório).

15.1. Procedimento

1. Fragmento é colocado num suporte com meio sintético (ex.: meio de congelação).
2. É congelado rapidamente (ex.: em crióstato).
3. O fragmento é cortado no crióstato.
4. Os cortes são apanhados em lâmina de vidro por aderência.
5. São fixados em álcool a 95%.
6. Ficam prontos para coloração e avaliação rápida.

16. Pontos-chave para o teste

• Saber definir:
• Fixação
• Autólise
• Putrefação
• Processamento histológico
• Saber objetivos da fixação e princípios gerais (4 pontos).
• Decorar as regras de uso do fixador líquido (tamanho do fragmento, volume 10x, pH, osmolaridade, tempo).
• Dominar as características do formol 10% tamponado (vantagens, desvantagens, penetração, tempo, toxicidade).
• Perceber o mecanismo de formação de artefactos e ser capaz de os reconhecer.
• Saber descrever as etapas do processamento: desidratação → diafanização → impregnação → inclusão → microtomia.
• Conhecer as regras de orientação dos fragmentos na inclusão (tubulares, epiteliais, císticos, vários fragmentos).
• Saber em que contexto usar cortes de congelação e descalcificação.