ADN "fabrique" ARN qui synthétise la protéine

• cette protéine va subir des modifications post-traductionnelle = lui permet d'être active et qui va alors être sécrétée dans le bon compartiment de sa fonction et va pouvoir faire effet

Notion de protéine recombinante

-> programmer une cellule pour la forcer à synthétiser une protéine d'intérêt

• protéine exprimée par des cellules
• dont l'ADN a été modifié par recombinaison génétique
• OU
• qui sont l'hôte d'un vecteur d'expression recombiné de traduire le gène d'intérêt

-> produire des protéines de manières contrôlées et en grande quantité

Produire une protéine recombinante

-> disposer de l'ADN codant pour la protéine

-> 5 étapes :

• clonage du gène d'intérêt dans un vecteur permettant son expression
• introduction dans l'hôte grâce au vecteur = transgenèse
• production par l'hôte de la protéine d'intérêt codée par le transgène
• extraction et purification de la protéine d'intérêt
• caractérisation de la protéine et vérification de son degré de pureté

Choix du vecteur d'expression

-> en fonction :

• de la protéine elle-même
• des modifications post-traditionnelle nécessaire à l'activité biologique de la protéine
• du compartiment cellulaire dans lequel la protéine exerce son activité biologique

Comment choisir un système d'expression

• par bibliographie
• avec des sites de prédiction
• par expérience

Système d'expression de protéines

-> les systèmes cellulaires

-> les organismes transgéniques

= chaque système à des avantages et inconvénients

Systèmes cellulaires

• bactéries
• levures
• baculovirus de cellules d'insecte
• cellule de plante, de mammifère

-> avantages et inconvénients des différents systèmes d'expression

Bactérie

-> très rapide et pas chère

-> cellules de mammifères ne sont pas plus avantageux

-> au niveau du rendement : efficacité en termes de pourcentage de quantité = quantité de protéine qu'on arrive à produire en utilisant tel ou tel système

-> modification post-traditionnelle : bactérie n'est pas capable de les assurer alors que les mammifères les assurent complètement

Cellules de mammifères en cultures

-> exemple :

• cellule vero de singe
• cellulaire humaine jurkat

= permettent la production de grosses protéines recombinantes complexes

Mais :

• faible rendemnt
• coût de production élevé
• système le plus utilisé pour la production d'anticorps monoclonaux et vaccins

Plantes

-> permettent la production de protéine en quantité très importante

Mais :

• apportent de modifications post-traductionnelle spécifiques aux plantes

-> fortement immunogènes pour des patients humains

-> technologie prometteuse mais à long terme

Animaux

-> production de la protéine d'intérêt dans le plasma ou le lait

• rendement de production est élevé
• modification post-traductionnelle proche de l'homme
• coût de production plus faible que les systèmes d'expressions cellulaires
• excellente alternative pour produire vaccins recombinants ou protéines thérapeutiques complexes

-> protocole : contraintes et solutions

• expression des protéines dans les bactéries dépourvues de protéases, important sinon elles vont dégrader les protéines d'intérêts
• cellules sont cultivées en grandes quantités
• problème : fort taux de croissance et une synthèse très importante des protéines recombinantes, elles deviennent toxiques pour elle-même, cellules meurent rapidement, système s'épuise rapidement = limite l'expression des protéines recombinantes
• pour résoudre ce problème, on peut faire un découplage entre
• une phase de croissance
• une phase d'expression

-> une cellule hôte procaryote présente certaines contraintes

• nécessité d'un promoteur procaryote pour que la bactérie puisse transcrire le gène d'intérêt
• bactérie ne fait pas d'épissage = ce pb est résolu par une construction à partir d'un ADNc

-> cependant la culture est facile et la croissance est rapide des bactéries

Protocole générale

• transformation de bactéries compétentes par le plasmide d’intérêt
• culture à partir des colonies obtenues
• bactéries compétentes sont traitées par CaCl₂ car il rend la membrane poreuse = facilite l’entrée des vecteurs à l’intérieur de la bactérie
• culture des bactéries
• milieu nutritif + un antibiotique adéquat à 37°C, jusqu’à une densité optique (DO) de 0,6 = phase exponentielle de la croissance bactérienne
• = bactéries se multiplient
• induction de l’expression des protéines par activation de la transcription du gène d’intérêt
• -> promoteur est impliqué
• récupération de protéine

Contrôle transcriptionnel

= transcription du gène codant pour la protéine d'intérêt est contrôlée à l'aide de promoteurs inductibles

• promoteurs thermosensibles
• promoteurs de l'opéron lactose

-> 3 gènes qui codent une protéine impliquée dans le métabolisme du lactose

• en aval = promoteur pour 3 gènes -> sites de contrôles en amont généré régulateur
• Lac Z qui code pour l’enzyme B-galactosidase
• Lac Y qui code pour l’enzyme perméase
• Lac A qui code pour la transacétylase
• en aval = gène I sous le contrôle de son promoteur qui code pour un répresseur de l'opéron lactose en se fixant sur l'opérateur = bloque la transcription de Lac Z, Y, A
• si transcription bloquée = pas de production de ces 3 protéines d'intérêts

-> 2 types de régulations de l'opéron

• en absence de lactose = expression constituée du répresseur
• une fois synthétisé -> répresseur se fixe sur l'opérateur
• SI se fixe sur l'opérateur = bloque la transcription des gènes situées en aval et donc pas de synthèse de protéine d'intérêt

• si on ajoute du lactose dans le milieu -> lactose inducteur capable de se lier sur le répresseur
• si formation d'un inducteur-répresseur -> répresseur ne peut pas se fixer sur l'opérateur
• opérateur = libre = transcription puis traduction puis synthèse des 3 enzymes

-> on peut prendre cet opéron mais il faut remplacer les gènes par les gènes d'intérêt = on peut contrôler la transcription en ajoutant du lactose

• si ajout alors transcription/traduction sinon blocage

-> on peut contrôler cette transcription = synthèse des 3 prot d'intérêt

• en ajoutant du lactose = transcription
• pas de lactose = bloque la transcription

-> si opérateur bloqué = pas de passage du ribosome = blocage

-> on peut maîtriser le moment où on va exprimer les prot d'intérêts

-> si lactose = répresseurs toujours synthétisés

Application à l'expression d'une protéine d'intérêt

-> modification de l'opéron lactose

• remplacement du gène Lac Z par la séquence du gène de la protéine d'intérêt
• utilisation d'IPTG = analogue artificiel du lactose

-> activation de la transcription

• IPTG permet l'expression d'une prot d'intérêt, en absence de l'IPTG = inhibition de la transcription du gène d'intérêt

Extraction des protéines

-> prot d'intérêts sont localisées dans le cytoplasme des bactéries

• nécessaire de lyser les bactéries pour récupérer les protéines
• par les procédés de sonication qui détruisent les mécanises par des ultrasons, et ajout d'un détergent qui réalise une lyse chimique

Vérification de l'expression des protéines

-> électrophorèse sur gel de polyacrylamide + SDS (sodium dodécylsulfate) = permet de charger les protéines négativement ce qui permet leur migration vers le pôle +

• on réalise le prélèvement d'un échantillon de l'extrait bactérien puis électrophorèse sur gel en condition dénaturantes

-> dénaturation des protéines se réalise par mélange avec le tampon de charge et de chauffage 5min à 95°C

-> composition du tampon de charge :

• glycérol
• colorant
• agents réducteurs
• détergent anionique
• protéine est soluble et chargée négativement

SDS permet :

• fixation sur les régions hydrophobes de la protéine
• charge intrinsèque de la protéine masquée par les charges négatives du SDS
• migration des protéines vers le pôle positif, sous l'action électrique
• séparation des protéines selon le poids moléculaire

Coloration ou transfert sur membrane

-> toutes les protéines fortement exprimées peuvent être détectées grâce à leur coloration dans le gel

• bleu de coomassie
• nitrate d'argent

-> des protéines en plus faibles quantités peuvent être détectées par Western Blot (protéines) après transfert sur membrane

= détection spécifique envers une seule protéine

-> à la fin de la migration = on récupère le gel et on fait un transfert du gel vers la membrane (de nitrocellulose)

• ajout de papier buvard
• par capillarité sous l'influence d'un courant électrique = transfert (dure entre 1 à 2h)
• à la fin on récupère la membrane et on jette le gel

Détection des protéines par Western Blot

= reconnaissance spécifique de la protéine d'intérêt à l'aide d'un anticorps dirigé spécifiquement contre cette protéine

1-

• saturation des sites non spécifiques par inculpation avec du lait (protéines du lait vont se fixer sur la membrane limitant la liaison des anticorps sur des sites non spécifiques)

2-

• incubation avec les anticorps primaires spécifiques : reconnaissance de la protéine par l'anticorps = liaisons anticorps - protéine d'intérêt

3-

• lavage de la membrane pour éliminer les anticorps qui ne se sont pas fixés

4-

• incubation avec l'anticorps secondaire qui reconnaît l'anticorps primaire
• sur l'anticorps secondaire est fixé : enzyme HRP

5-

• lavage de la membrane

6-

• révélation du Western Blot = ajout du substrat de l'HRP
• réaction enzymatique transforme se substrat en un produit luminescent

7-

• lumière émise est détectée sur un film photosensible ou par une caméra

-> protéines recombinantes sont ainsi :

• exprimées en grandes quantités
• mais mélangées avec les protéines bactériennes

= nécessité de purifier la protéine d'intérêt

Purification des protéines

Chromatographie d'affinité

= immunopurification : utilisation de l'interaction anticorps/ligand

-> cette technique est spécifique de la protéine étudiée

• anticorps reconnaissent la protéine sont fixés à des billes

1-

• dépôt de l'extrait cellulaire sur la colonne

2-

• après lavage : élimination des molécules interagissant de façon peu spécifique
• = protéines d'intérêt peuvent être éluées avec par exemple un peptide compétiteur

-> contraintes

• disposer d'un anticorps suffisamment efficace et spécifique
• disposer de système d'élution performants
• d'où l'utilisation d'autres systèmes de chromatographie d'affinité reposant sur :
• des interactions ligand/récepteur du ligand
• utilisation d'une protéine recombinante fusionnée à une étiquette

exemple de TAG :

• 6 His (polyhistidien) -> ligand = métaux chélatés
• glutathion S tranférase (GST) -> ligand = glutathion

Protéine de fusion

= construction du gène codant la protéine de fusion par PCR

• ou d'insertion du gène d'intérêt dans un plasmide contenant le TAG

-> pour se débarrasser du TAG = site de coupure pour ne récupérer que la protéine d'intérêt

Chromatographie d'affinité

-> les récepteurs du ligand fixés sur la colonne interagissent avec le TAG

• toutes autres protéines non retenues sont éliminées donc les protéines bactériennes sont éliminées car ne sont pas retenues car pas de TAG

-> réalisation d'une chromatographie d'affinité pour la purification des protéines

-> après élution, on obtient la protéine d'intérêt fusionnée

• comment éliminer le TAG ?
• clivage entre la protéine d'intérêt
• nouveau passage sur colonne d'affinité pour retenir les TAG et récupère la protéine purifiée
• on repasse l'échantillon dans la colonne, on retient le TAG et on récupère la protéine d'intérêt purifiée