I. INTRODUCTION
L’information génétique est située dans le noyau des cellules pour le génome nucléaire (+ le génome mitochondrial
Toutes les cellules de l’organisme ont le même génome ; cependant celui-ci s’exprime différemment en fonction des cellules, de leur rôle, de leur localisation, et de leur environnement.
Ex : la transformation de la chenille en papillon est due à une régulation différente des gènes. Il y a une expression différente des ARNm (transcriptome) qui donneront par la suite des protéines (protéome).
Les différents niveaux de régulation : depuis la transcription, jusqu’à la synthèse d’une protéine fonctionnelle.
➔ Chez les eucaryotes, la régulation se fait majoritairement au niveau de la transcription : C’est un contrôle du niveau d’expression des ARNm qui dépend beaucoup des facteurs environnementaux. Il dépend également d’autres mécanismes, liés à la régulation de l’épissage, au contrôle de la stabilité des ARNm, à la régulation de l'initiation de la transcription, et au contrôle de la stabilité des protéines.
➔ Chez les procaryotes, il y a autant de mécanismes transcriptionnels que traductionnels.
➔ Ces mécanismes sont liés :
- à la régulation de l’épissage
- au contrôle et à la stabilité des ARNm
- au contrôle de la stabilité des protéines
Le génotype correspond au génome, il est très conservé, constant et commun à toutes les cellules somatiques.
Le transcriptome est l’ensemble des ARN (messagers, ribosomiques, de transfert et non codants) exprimés à un moment donné dans un tissu donné. Certains ARN (les ARNnc) sont capables de réguler l’expression des gènes. Ils conduisent à l’expression des gènes par un processus dynamique et variable, en fonction du tissu et de l’environnement.
Le protéome est l’ensemble des protéines présentes dans une cellule.
Le phénotype correspond à la manière dont les gènes sont exprimés, et les conséquences sur l’aspect macroscopique de l’individu.
Analyse transcriptomique = analyse qui permet d’identifier les gènes actifs à un moment donné dans un tissu donné.
L’expression des gènes est un phénomène très dynamique, qui varie en fonction de l’environnement. 8% des gènes jouent un rôle dans la régulation de l’expression des gènes.
Ex passage de la chenille au papillon -> même ADN, mais transcriptome différent
Ex : le sexe des tortues est déterminé au niveau transcriptomique en fonction de la température (facteur environnemental thermique). Si la température est comprise entre 30et 33°C, la tortue sera une femelles, alors qu’entre 28 et 30°C ce sera un mâle.
II. REGULATION TRANSCRIPTIONNELLE II.
A. L’OPERON LACTOSE :
Il est présent uniquement chez les bactéries (procaryotes) :
Définition : l’opéron lactose est une unité d’ADN fonctionnelle regroupant des gènes qui opèrent sous le signal d’un même promoteur, qui régule leur transcription. Ces gènes concourent à la régulation d’une même fonction physiologique.
Observation de Jacob et Monod : Certaines bactéries n’étaient capables de grandir qu’en présence de glucose. Mais si on les forçait à les faire grandir uniquement en présence de lactose, elles finissent par y arriver
→ on en déduit donc que les bactéries convertissent le lactose en glucose.
Ceci se fait par induction d’une Enzyme la β-galactosidase ou lactase.
1. Structure de l’opéron lactose :
3 gènes :
o Lac Z : code pour une ß galactosidase : hydrolyse le lactose en glucose.
o Lac Y : code pour une perméase : transporte le lactose vers l’intérieur de la cellule.
o Lac A : code pour une acétylase.
En amont du groupe de gènes se trouvent des régions régulatrices :
o O = opérateur: région où s’installe le répresseur → si le répresseur est présent, pas de transcription.
o P = promoteur : l’ARN polymérase se positionne sur cette région pour initier la transcription.
o Lac l = répresseur: code pour un répresseur de l’expression de ce groupe de gènes. Capable de bloquer l’opéron lactose.
NB : L’activation de la transcription nécessite la fixation du complexe CAP/AMPc sur le promoteur.
2. Mécanisme de l’opéron lactose :
En présence de glucose et pas de lactose : Pas besoin de cliver le lactose, donc l’opéron est réprimé. Lac I synthétise un répresseur qui va se fixer sur O, ce qui bloque la transcription de l’ensemble de ces gènes (car l’ARN pol ne peut pas se fixer) → donc pas de β-galactosidase.
En présence uniquement de lactose : La bactérie a besoin de s’adapter pour proliférer, car elle n’utilise normalement que du glucose (glc). Il y a donc expression de Lac Z. Ici il y a peu de glc, ce qui entraine une augmentation de l’AMPc, qui va se fixer sur CAP, qui va lui-même se fixer sur le promoteur (CAP en l’absence d’AMPc est incapable de se fixer sur le promoteur). Le répresseur va également être piégé par le lactose. Ceci entraine une accessibilité du promoteur pour l’ARNpol → il y a alors transcription, l’opéron est activé.
NB pour retenir : il y a une augmentation de AMPc, car tout l’ATP issu de la glycolyse est consommé et se transforme en AMP. Il n’y a plus de glc, donc plus de glycolyse et donc plus de formation d’ATP, d’où l’augmentation de l’AMPc.
En résumé, on a donc besoin de 2 choses pour permettre l’activité de l’opéron :
- Absence de glucose, donc pas de source d’énergie, donc augmentation de l’AMPc → liaison avec CAP, pour aller sur le promoteur, et ainsi recruter l’ARN polymérase.
- Présence de lactose, qui bloque le répresseur pour laisser l’opérateur libre.
En présence de glucose et de lactose : la bactérie va préférer utiliser du glc plutôt que du lactose, car cela demande moins d’énergie. CAP ne va pas pouvoir se fixer, car il n’y a pas assez d’AMPc. L’opéron est donc réprimé, donc pas de transcription.
Ici, on a donc la présence de lactose qui bloque le répresseur, mais également la présence de glucose. Le glucose est donc une source d’énergie (même si en faible quantité), et suffit pour diminuer les AMPc. Il n’y a donc pas de liaison avec CAP, donc pas de recrutement de l’ARN pol (donc pas de transcription).
Cette observation nous apprend deux choses (important) : La transcription d’un groupe de gènes peut être régulée par la fixation de l’ARN pol sur le promoteur. Cette régulation peut être positive (activation transcription) ou négative (inactivation), par liaison de facteurs trans (répresseur, AMPc-CAP) sur des séquences d’ADN régulatrices cis en amont du gène.
II.B. CONTROLE AU NIVEAU DU SITE PROMOTEUR :
1. Définition et structure du promoteur :
On étudie ici le promoteur eucaryote et non pas procaryote. Leur structure est différente,mais leur rôle est le même. On trouve des éléments régulateurs de 2 types :
Promoteurs cis régulateurs = Séquences d’ADN qui sont identiques dans toutes les cellules pour un même gène donné, mais dont les séquences sont différentes entre les différents gènes d’une même cellule.
o Ils sont sur le même brin que le gène régulé (en amont de celui-ci )
o Toutes les séquences sont situées en amont du gène régulé.
o Les promoteurs / sequences cis reg dépendent de la nature (expression et activité) des facteurs trans, qui les lient en réponse à des stimulis externes spécifiques : c’est ce qu’on appelle le contrôle combinatoire.
Si les séquences activatrices ET inhibitrices sont fixées, on a une inhibition de la transcription, causée par la présence de l’inhibiteur.
Promoteurs trans régulateurs = séquences codées par d’autres régions du génome → elles vont agir indirectement, en synthétisant des protéines (facteurs de trans/ co-activateurs) qui vont interagir en se fixant sur des séquences cis régulatrices. Ils sont appelés facteur trans ou facteur de transcription.
o L’expression et l’activité des facteurs trans (= éléments trans régulateurs) sont régulés par des facteurs extérieurs, ils ne sont donc pas toujours présents ou activés (contrairement aux cis régulateurs qui sont toujours présents).
o La combinaison de tous les facteurs trans, grâce à un médiateur, permet le recrutement de l’ARNpol et donc l’initiation de la transcription.
o La seule fixation de l'ARN pol ne suffit pas, il faut que d’autres facteurs de transcription viennent se fixer pour initier cette transcription.
Structure du Promoteur qui correspond aux séquences cis régulatrices :
o Boite TATA (TAATAAA) : lieu de fixation du facteur général de la transcription TFIID et du complexe basal/d’initiation de la transcription.
o Inr = site d’initiation de la transcription.
o BoitesGC et CCAAT: Elles sont en amont des séquences promotrices, ce sont des séquences régulatrices proximales. Elles sont le lieux de fixation de facteurs spécifiques, qui sont indispensables à la transcription basale → ce sont des séquences cis-régulatrices.
o Boites « Séquences régulatrices »distales : (parfois situées à + de 1000 bases de l’initiation ) = Sur ces séquences viennent se fixer les facteurs régulateurs = facteurs trans (activateurs ou freinateurs) de la transcription. Ces séquences sont également appelées les « Réponses éléments »(= RE). Elles sont spécifiques de chaque gène. Ce sont des séquence CIS régulatrice également, mais elles sont plus distales par rapport au gène. Elles sont soit :
o Activatrices de la transcription = ENHANCERS
o Soit inhibitrices de la transcription = SILENCERS
➔ L’effet régulateur dépend de la nature des facteurs trans qui les lient en réponse à des stimuli externes spécifiques → c’est le contrôle combinatoire.
/!\ Si, dans une région régulatrice, on retrouve un activateur et un inhibiteur de la transcription, on aura au final une inhibition de la transcription.
2. Facteur trans régulateur :
Définition : protéine codée (action indirecte ) par un gène situé sur d’autres régions du génome (pas sur le même brin que le gène régulé), qui vont agir en se fixant sur les séquences cis régulatrices . Leur activation est très régulée, notamment grâce à :
o Un contrôle de la transcription, dans le temps et dans l’espace, en fonction des conditions environnantes.
o Des facteurs synthétisés ou activés à des instants spécifiques, ou dans des tissus spécifiques.
o Un contrôle combinatoire : on retrouve des effets différents en fonction des autres protéines présentes.
o Une adaptation très fine du transcriptome.
L’expression et l’activité des facteurs trans sont donc contrôlées précisément par des facteurs extérieurs/signaux moléculaires : c’est un mécanisme très dynamique.
Ex de facteurs trans régulateurs : les récepteurs nucléaires.
Structure des facteurs trans régulateurs : Les facteurs trans sont capables d’agir sur l’ADN en s’y fixant: ils ont donc des domaines de liaison (4 types) à l’ADN + un domaine d’action sur la transcription. Ce dernier permet au facteur trans d’interagir avec d’autres facteurs de transcription.
4 types de domaines de liaison à l’ADN :
➔ Hélice-tour-hélice :
o Très présent chez les procaryotes et peu chez les eucaryotes
o Hélice α – coude β – hélice α
o Interaction via des charges + (AA chargés positivement) avec le grand sillon de l’ADN.
Ces trois suivants sont surtout retrouvés chez les eucaryotes :
➔ Hélice boucle/tour hélice :
o Hélice à homéodomaine
o 2 hélices alpha séparées par une boucle
o Dimère qui prend en tenaille l’ADN
o Régulation des gènes homéobox impliqués dans le développement embryonnaire
➔ Doigt de zinc :
o 1 seule chaîne peptidique qui se replie sur elle-même, et qui est stabilisée grâce à l’ion Zn2+ , qui va former des liaisons de coordination avec 4 cystéines ou 2 Cystéines et 2 Histidines.
o Il va former une boucle avec des AA hydrophobes/ basiques, qui va interagir avec l’ADN.
o Les domaines sont à 2 doigts de zinc pour pouvoir se lier à ADN.
o Boucle chargée + (AA basiques) ou hydrophobes → permet l’interaction avec l’ADN (chargé -)
➔ Leucine zipper = glissière à leucine :
o Les leucines sont tous les 7 AA
o Régions riches en AA très basiques (chargé +), qui interagissent avec l’ADN (chargé -)
o Le dimère est réalisé par des liaisons hydrophobes entre les leucines
Les domaines de leucine zipper vont être capables de s’associer en homodimères ou hétérodimères.
Chaque chaine reconnaitra une séquence donnée de l’ADN, donc un homodimère permettra un contrôle de reconnaissance d’une séquence de l’ADN, alors qu’un hétérodimère en reconnaitra deux. Ces facteurs peuvent s’associer, et ainsi former des dimères.
Si ce sont deux mêmes facteurs, alors le dimère formé est appelé homodimère (ex : 2 leucines dans la leucine zipper).
Si les deux facteurs sont différents, cela forme donc un hétérodimères (ex : une leucine zipper et un doigt de zinc).
3. Différents types de contrôles par des facteurs trans :
La liaison de l’activateur à l’enhancer facilite le recrutement de l’ARN polymérase II.
La liaison de l’inhibiteur au silencer empêche le recrutement de l’ARN polymérase II.
Ex : site avant un gène, avec 2 activateurs (+) et 1 inhibiteur (-)
➔ Si seulement les 2 + : alors transcription
➔ Si seulement un + → très peu de transcription ou pas du tout
➔ Si les trois (2+ et 1-) → pas de transcription
Inhibition compétitive :
o Soit par fixation de l’inhibiteur (silencer), qui va empêcher l’activateur (enhancer) de se fixer (par encombrement stérique), et donc empêche la transcription de s’initier. C’est laproximité enhancer/silencer. Cela est également possible dans l’autre sens (le premier arrivé est en quelque sorte le premier servi).
o Soit par fixation de l’inhibiteur près de la TATA box → empêche la fixation du complexe d’initiation de la transcription. Inhibition par masquage du domaine d’interaction de l’activateur : L'activateur et l’inhibiteur ont bien reconnu leurs séquences régulatrices,mais l’inhibiteur va venir réprimer le domaine d’interaction de l’activateur avec les facteurs de transcription. Répression directe :
o Tout se fixe, donc pas d’encombrement stérique. Cependant, l’inhibiteur agit pour bloquer l’initiation de la transcription en bloquant le complexe d’initiation. Il va masquer le domaine d’interaction de l’activateur avec les facteurs de transcription.
o À condition d’une proximité entre le silencer et TATA box Répression indirecte :
o Très importante chez les eucaryotes.
o La fixation de l’inhibiteur va modifier la structure de la chromatine, et donc l’accessibilité du site d’initiation par l'ARNpol. Ceci empêche la fixation du complexe d’initiation. Cette répression indirecte est donc permise par une régulation épigénétique (méthylation, etc… qui joue le rôle d’inhibiteur), qui se régule par des cofacteurs.
La nature de la fixation des facteurs trans dépend des tissus et entraînera des conséquences variables : régulation TISSU-spécifique de l’expression des gènes (pas besoin de retenir les différents tissu, il faut juste retenir que c’est une régulation qui dépend des tissus)
II.C. MODELAGE DE LA CHROMATINE :
L’ADN a besoin d’être très compacté pour rentrer dans le noyau, pour cela il régule sa compaction autour des histones, formant ainsi les nucléosomes. L’ADN est réparti en 2 types de chromatine :
l’euchromatine, la moins compacte, qui est transcrite car riche en gène,
l’hétérochromatine, très compacte, dans laquelle il n’y a pas de transcription car pas de gènes.
➔ Les nucléosomes: ils sont constitués d’histones riches en lysine et arginine (+) en interaction avec l’ADN et ses groupement phosphates (-).
Il existe une modification post traductionnelle des histones :
o Soit une acétylation : via des HAT (Histone Acetyltransférase) → l’acétylation fait disparaitre les charges + des lysines (ce sont elles qui subissent l’acétylation généralement), il y a alors moins d’interactions histones (+) et ADN (-), et un encombrement stérique plus important du fait du groupement acétyle. Ceci entraine alors une décompaction de l’ADN. C’est un processus réversible.
La Lysine acétylée est reconnue, et permet la fixation d’autres HAT → cela amplifie le phénomène, et permet une ouverture de la zone au promoteur.
o Soit une désacétylation : via HDAC (Histone Désacétylase) (= enzyme inverse de la HAT), qui enlève le groupement acétyle, et donc entraine une compaction de l’ADN. Recrutement de protéines à bromodomaines ou à chromodomaines :
✓ Acétylation : recrutement d’acétyltransférases (HAT) → décompaction de l’ADN, et amplification de son expression.
✓ Méthylation : recrutement de répresseurs (HDAC) → compaction de la chromatine, donc diminution de l’expression.
➔ Il existe également une possible méthylation de l’ADN sur les ilots CpG, qui permet le recrutement des éléments répresseurs MeCP1 et MeCP2. Cela entraine une désacétylation des histones via le recrutement des HDAC, ce qui induit donc la condensation de la chromatine, et ainsi la répression de la transcription.
Ex (pas donné en cours mais pour votre compréhension) : un gène utile au niveau du foie peut n’avoir aucune utilité dans le cerveau. La transcription dans le cerveau est alors réprimée grâce à une méthylation de l’ADN (entre autre), qui le compacte.
Le code histone : Le code histone montre des modifications sur des sites très précis des AA. Cela joue donc un rôle dans la compaction de la chromatine, et dans l’accessibilité des facteurs de transcription.
Les histones sont partiellement transmissibles de la cellule mère à la cellule fille ; l’information génétique est donc potentiellement conservée. T
Phénomène de méthylation de l’ADN : La méthylation de l’ADN (chez les eucaryotes) se fait sur les cytosines, qui donnent alors la 5-méthylcytosine. Elle se fait par des ADN méthyltransférases. Certains gènes ont, dans leurs promoteurs, des ilots CpG, qui sont reconnus par les méthyltransférases, qui méthylent les cytosines des ilots. Cette méthylation des cytosines entraine une inactivation de la transcription.
Les DNA méthyltransférases peuvent méthyler à partir des Adénosyl méthionines.
Suite à la méthylation des CpG (mCpG), on observe la liaison de répresseurs: MeCP1 et 2. Ces derniers vont conduire au recrutement de HDAC (qui sont des co-répresseurs), et donc entrainer une désacétylation
→ fermeture de la chromatine, donc accessibilité à la polymérase impossible → cela induit donc l’inhibition de la transcription.
➔ Pathologies :
o Cancer : il existe des gènes suppresseurs de tumeur(p53), qui ont pour fonction de tuer la cellule qui devient tumorale. S’il y a une hyper méthylation des ilots CpG des gènes suppresseurs de tumeur (expression -) et une hypométhylation des promoteurs des oncogènes (donc expression ++), cela aboutit au processus de cancérisation.
o Glioblastomes : Le statut méthylé ou non de MGMT va constituer un facteur de réponse prédictif aux traitements des glioblastomes: le TMZ. Le TMZ est un agent alkylant, c’est à dire qu'il va ajouter un groupement méthyl sur les bases puriques de l’ADN. Les conséquences de cette méthylation sera l’apparition de sites qui vont être reconnus par les systèmes de réparation de l’ADN, et qui vont induire l’apoptose de la cellule. L’activité de la TMZ va être diminuée en présence de l’enzyme MGMT. La MGMT est une enzyme spécialisée dans l’élimination des groupements méthyl anormaux, c'est une enzyme réparatrice de l’ADN.
Le promoteur du gène MGMT est riche en séquences CpG. Si on a une hyperméthylation des CpG, alors on perd l’expression de MGMT. Le traitement par TMZ ajoute groupement méthyl, donc il n’y a pas de réparation des méthylations de l’ADN, ce qui induit l’apoptose des cellules avec méthylation anormale.
Ainsi, les patients qui ont un promoteur méthylé du gène codant pour la MGMT vont très bien répondre à ces chimiothérapies.
➔ Notion d’empreinte parentale
Hérédité mendélienne : chaque individu possède un gène des 2 parents: les infos de la copie du père et de la mère sont équivalentes (indépendamment du sexe du parent).
Le phénomène d’empreinte parentale :
o Il s’agit d’une expression hémizygote de certains gènes, c’est à dire une expression hémizygote suite à des modifications épigénétiques dans les cellules germinales des parents. L’expression ne concernera donc qu’un seul des deux chromosomes de la paire. Ces modifications n’affectent pas la séquence codante. Il s’agit en effet de méthylation de l’ADN, méthylation/acétylation des histones… (épigénétique)
o Ce phénomène consiste en la répression stable de l’expression d’un gène porté par un chromosome (autosome), en fonction de son origine parentale.
Pendant la gamétogenèse : méthylation différentielle du centre d’empreinte de l’allèle paternel ou maternel.
Implique fréquemment des ARN non codants.
o Lorsque le centre d’empreinte est méthylé, le gène ne va pas s’exprimer.
C’est un phénomène de méthylation différentielle entre allèle du père et de la mère, au niveau du centre d’empreinte pendant la gamétogénèse ; (il implique souvent des ARNnc). Le centre d’empreinte est donc très important pour la méthylation différentielle.
/!\ Retenir que l’empreinte parentale est une expression monoallélique (=hémizygote).
II.D. TRANSDUCTION DU SIGNAL :
1. Le fonctionnement des facteurs régulateurs :
Les facteurs environnementaux se situent à l’extérieur de la cellule, et vont conduire à une signalisation intracellulaire de deux types : facteurs liposolubles et hormones liposolubles(attention : ceux-là ne sont pas en permanence sur le noyau, ils peuvent se trouver dans le cytosol). On obtient alors une cascade de signalisation, qui va agir sur plusieurs cibles transcriptionnelles.
➔ Facteurs hydrosolubles: (EGF/ GH). Ils circulent dans le sang, mais ne peuvent pas rentrer dans les cellules (à cause des bicouches lipidiques —> hydrophobe). Ils se fixent donc sur des récepteurs extracellulaire/membranaires.
➔ Hormones liposolubles: (stéroïdes/ T4) : vont être capable de diffuser dans la membrane et vont agir après, via des récepteurs nucléaires.
C’est l’interaction entre ces différents facteurs qui va contrôler le niveau d’expression des gènes. Régulation de l'expression des gènes
2. Les facteurs hydrosolubles (ne pas confondre avec les facteurs de transcription) :
Le but du phénomène de transduction est l’activation de protéines cibles. La transduction passe par la fixation d’un facteur (ligand) à l’extérieur de la cellule, sur un récepteur membranaire. Cela entraine un signal intracellulaire, qui va permettre l’activation d‘un très grand nombre de facteurs, dont des facteurs de transcription, qui permettront la régulation de l’expression des gènes. Le but de cette signalisation est d’aller activer des protéines cibles parmi lesquelles on peut avoir des facteurs de transcription.
Exemple : facteur de trans CREB :
o Ce facteur de trans possède un domaine activateur de la transcription et un domaine de liaison à l’ADN de type leucine zipper. Il y a donc formation d’un dimère, puis interaction à l’ADN via des AA basiques et hydrophobes.
o Il contient un site de régulation dans son domaine activateur de la transcription, une boite P qui possède une sérine, qui peut être phosphorylée. (On ajoute 1 Phosphate sur la sérine)
o CREB a besoin d’être phosphorylée sur la sérine de la boite P pour fonctionner (se dimériser puis aller se fixer et agir puis activer la transcription).
Mécanisme d’action de CREB :
1) Augmentation de l’AMPc dans la cellule suite à :
• Une carence en glucose
• Ou une variation de concentration calcique (Ca2+)
• Ou l’action d’une protéine liposoluble
2) La présence d’AMPc va activer la protéine kinase PKA.
3) La PKA phosphoryle le OH de la sérine de la boite P de CREB.
4) Dimérisation et translocation de CREB dans le noyau et interaction avec CRE (séquence régulatrice distale de l’ADN) .
5) Recrutement de la polymérase II, et activation de la transcription
3. Les hormones liposolubles :
Sur ces composés, on retrouve les domaines activateurs de la transcription (point commun avec les facteurs hydrosolubles), mais aussi un domaine de fixation au ligand (absent chez les facteurs hydrosolubles).
o Agissent directement au niveau nucléaire car passent la bicouche lipidique (diffusion libre).
o Elles se fixent à des récepteurs intracellulaires spécifiques, qui n’existent que dans les cellules cibles.
o Ce récepteur se dimérise, entre dans le noyau puis se lier à l’ADN au niveau d’un Response Element (RE). (!!! attention : récepteur nucléaire ≠ hormone liposoluble !!!)
Ex des récepteurs nucléaires aux hormones stéroïdiennes : présents dans les cellules qui en ont besoin
➔ Dans le cytoplasme, le récepteur nucléaire est couplé à HSP90 quand il n’y a pas de régulation (=protéine chaperonne inactivatrice).
➔ Puis il y a la liaison de l’hormone stéroïdienne au récepteur, entrainant une dissociation de HSP90.
➔ Puis on a le passage du complexe dans le noyau.
➔ S’en suit la dimérisation, avec un autre récepteur de même type (=homodimère) ou de type différent (=hétérodimère), puis la liaison au RE.
➔ Cette liaison entraine le recrutement des HAT, qui entrainent à leur tour l’activation de la transcription.
NB : l’hormone liposoluble est ici l’hormone stéroïde, qui se fixe sur un récepteur intracellulaire appelé récepteur nucléaire (mais qui est situé dans le cytoplasme à l’origine, attention au nom !!).
III. REGULATION POST-TRANSCRIPTIONNELLE :
III.A. CONTROLE DE L’EPISSAGE :
L’épissage, permettant de passer d’un préARN à un ARNm mature, est régulé au niveau :
o Des sites ESE / ISE (= Exonic/Intronic Splicing Enhancers) : respectivement situés dans les exons ou introns, proximité des sites accepteurs et donneurs d’épissage, et du A de branchement (cf cours sur la transcription). Sur ces sites vont être recrutées des protéines : ce sont les protéines S/R, qui vont permettre un bon recrutement du spliceosome
Aide au recrutement du spliceosome → sites activateurs qui favorisent l’épissage.
o Des sites ESS / ISS (= Exonic/Intronic Splicing Silencers) : lieu de fixation de protéines qui vont empêcher la fixation du spliceosome.
➔ Conséquences : ceci entraine un épissage alternatif.
Épissage normal : tous les introns sont épissés et on se retrouve avec tous nos exons.
Épissage alternatif (isoformes d’épissage) : en fonction des lieux où se fixent les protéines S/R on va avoir élimination de certains exons, il y aura ainsi modification de la qualité des ARNm (et cela peut être pathologique). Il peut également y avoir des mutations qui vont favoriser l’élimination ou non d’exons alors qu’ils ne le devraient pas.
III.B. CORRECTION DE L’ARNM :
Définition : la correction de l’ARN ou RNA editing est une modification de l’ARN, le rendant différent de la séquence d’ADN dont il est issu. Il est transcrit et épissé normalement, mais il peut être modifié une fois transcrit, et sera ainsi différent du transcrit primaire. Les isoformes produits seront tissus spécifiques.
La modification peut se faire :
o Soit par insertion / délétion de plusieurs uridines dans l’ARNm, ce qui entraine donc un décalage du cadre de lecture.
o Soit par substitution de bases.
➔ Mécanisme de l’insertion/délétion de plusieurs uridines :
- L’ARNm qui doit être corrigé doit d’abord être clivé par une endonucléase.
- Pour certains ARNm, un ARN non codant et complémentaire à l’ARNm va être transcrit dans une autre région du génome. C’est ce qu’on appelle un ARN guide.
- L’ARN guide va s’hybrider aux deux régions de l’ARNm qui ont été clivées par l’endonucléase.
- Les mécanismes de réparations vont ensuite resouder les deux parties entre elles, en utilisant comme modèle la séquence de l’ARN guide qui les lient entre elles. Ils vont donc ajouter des U car l’ARN guide est constitué d’une région riche en A (par complémentarité on a A→U).
- Très souvent, cela va entrainer un décalage du cadre de lecture, et donc un épissage alternatif ou des stops prématurés.
➔ Ex de substitution de bases : gène de l’ApoB (transport des lipides) :
- Dans le foie, pas de modification de l’ARNm (29 exons) → ApoB100 qui permet de transporter les lipides et reconnaitre certains récepteurs cellulaires. Pas de modification de l’ARNm il y a la protéine entière.
- Mais dans l’intestin, phénomène de désamination oxydative par une cytidine désaminase, qui va transformer le CAA en UAA, ce qui fait apparaitre un codon stop prématuré. La protéine est alors tronquée : on parle d’apo B48 (48% de la séquence initiale), qui permet seulement le transport des lipides.
L’organisme est capable de modifier l’expression d’un gène en allant modifier l’ARNm.
➔ Autre mécanisme de substitution : le système ADAR
ADAR est une adénosine désaminase, et appartient à une famille de protéines qui va agir sur les ADN double brins en forme d’épingle à cheveux. Elles vont transformer les adénosines en inosines, qui seront ensuite traduites comme des guanosines. Les cellules neuronales immatures deviennent matures en transformant leurs adénosines en inosines.
Ainsi, un problème au niveau de l’enzyme ADAR conduit à des problèmes de maturation des neurones, et donne des pathologies.
III.C. CONTROLE PAR DES ARNS NON CODANTS :
Les ARN non codants (ARNnc) sont divisés en plusieurs classes d’ARNs : les ARNs interférents (ARNi) et des longs ARNs (lncARN)
1. Les ARNs interférents:
ARN interférents: désigne un acide ribonucléique simple ou double brin, qui interfère avec un ARNm spécifique, conduisant à sa dégradation et/ ou la diminution de sa traduction en protéine.
2 classes d’ARNi :
o Les small interfering RNA(siARN) = premiers outils permettant de mieux comprendre les mécanismes de modifications post-transcriptionnelles
Double brin
Introduit par le chercheur dans la cellule (en BM), pour réguler positivement ou négativement un gène. Il a donc une origine exogène.
Cible spécifique déterminée par sa séquence (choisie par le chercheur).
Leur découverte est une révolution (avant pour étudier la fonction d’une protéine on utilisait la souris KO avec un gène invalidé).
o Les micro ARN (miARN) :
Simple brin et de petite taille, non-codants.
Sont codés par l’ADN pour contrôler l’expression de 60% du génome humain.
Ont plusieurs cibles (1 miARN pour différents ARNm cibles grâce au principe de complémentarité totale OU partielle →régulation dépendante de cette complémentarité).
Ont une activité tissu-dépendante (associée à un tissu spécifique)
Sont associés à de nombreuses pathologies : importance dans le cancer, puisque ce sont des cibles importantes et prometteuses en thérapie ciblée (influencer la régulation des ces miARN pour réguler de manière indirecte l’expression des gènes).
Production des miARN :
➢ Ils sont sous la dépendance d’un promoteur. Ces gènes sont sous forme de séquence palindromique (séquence répétée et inversée cf cours du Pr. FERRARO).
➢ Origine endogène car codés par des séquences introniques de gènes non codants.
➢ Ils ont la propriété de se replier en épingle à cheveux. Un de ces brins va être capable d’aller s’associer aux ARNm cibles par hybridation et par complémentarité de séquence, et ainsi de contrôler leur stabilité (dégradation, inhibition…).
1. Transcription du gène, ce qui forme un pri miR, qui se replie tout de suite sur lui-même (présence des séquences palindromiques (répétées et inversées) qui font que l’ARN se replie sur lui-même pour former une structure en tige de 1000nt).
2. Puis DROSHA (endonucléase, RNase) va le couper (clivage) pour donner le prémiR.
3. Celui-ci va être reconnu et exporté (par l’exportine + GTPase Ran) dans le cytosol. → Exportation possible puisqu’il devient plus court = 100nt.
4. Il va être reconnu par une RNase III = DICER (endonucléase) qui va le cliver. Elle le coupe en une + petite structure en enlevant la boucle, ce qui donne deux structures simples.
5. Il va y avoir une dégradation du brin passager (étoile).
Le brin actif (guide) = « vrai miARN » va être pris en charge par une protéine Ago2 ce qui va former le complexe RISC. Ce dernier va être guidé vers un ARNm spécifiquement sur la séquence qui est complémentaire au miRNA.
Le micro-ARN mature fait 21 à 24 nt.
Modes d’action des miRNA : Lors de la traduction, l‘ARNm n’est pas sous forme linéaire, mais sous forme de boucle. Il existe desfacteurs eiF qui fixent la CAP en 5’, et des complexes protéiques qui fixent la queue polyA.
La boucle formée permet à la queue poly A de protéger l’ARNm en 3’ contre les exonucléases.
L’appariement entre ARNm et miARN peut être de plusieurs sortes :
o Si complémentarité parfaite :le miRNA se fixe parfaitement au niveau des 21 nt de sa séquence, et il y a un clivage de l’ARNm par le complexe RISC. (Rarement le cas chez eucaryote).
o Si complémentarité imparfaite : il y a un blocage de la traduction Dans ce cas-là, le complexe RISC se fixe partiellement ce qui entraine le recrutement et le déplacement de certaines protéines au niveau de la queue poly A, qui va être clivée, ce qui va déstabiliser l’ARNm.
Elle sera alors reconnue par les ribonucléases (exonucléases), conduisant à un clivage/dégradation par l’extrémité 3’. Finalement il n’y a plus de traduction. (Plus retrouvée chez les eucaryotes).
o Autre situation : complexe RISC se fixe en 3’UTR et bloque la traduction en empêchant la fixation des sous unités ribosomiques ou en bloquant l’activité du ribosome.
Dans tous les cas, il n’y a pas traduction de l’ARNm → non expression du gène.
2. Les longs ARN non codants ou lncARN :
Leur taille est supérieure à 200nt. Ce sont des ARN longs non codants → ils ne codent pas de protéines .
Les longs ARN non codants ont une activité locale (= sur le même chromosome) ou distale (sur d’autres chromosomes).
Ils sont transcrits par l’ARNpol II à partir de gènes situés :
o Entre les gènes codants
o Dans les introns des gènes codant
o Sur les brins inverses des gènes codants
o A partir de leur propre promoteur
Ils sont présents dans le cytoplasme et dans le noyau.
Modes d’action : Ils sont capables d’interagir avec l’ADN ou d’autres protéines afin de :
- Constituer des complexes d’échafaudages multi protéique
- Piéger les facteur trans
- Contribuer à la régulation épigénétique: en permettant d’amener des protéines sur l’ADN (ex : HAT / HDAC). Participer à la structuration du complexe de régulation transcriptionnelle.
- Dégrader les ARNm non-sens
- Permet un contrôle qualité des ARNm
- Elimination des ARNm avec codon STOP prématuré donc inutiles
- Evite la production de protéines tronquées et de ses effets délétères
Processus qui a lieu au niveau cytoplasmique chez les eucaryotes
III.D. REGULATION DE LA TRADUCTION :
Elle est très développée chez les procaryotes mais peu chez les eucaryotes.
Elle a lieu dans le cytoplasme, contrairement à la voie transcriptionnelle, qui a lieu dans le noyau. La régulation peut faire intervenir un régulateur traductionnel exogène (protéine ou ARN), qui va interférer sur la traduction via le ribosome, en réponse à un signal extérieur.
Le régulateur peut avoir un effet activateur ou inhibiteur de la traduction.
➔ L’initiation de la traduction : Régulation de la traduction par la voie mTOR
- Recrutement de la petite sous-unité du ribosome au niveau de la CAP de l’ARNm, grâce aux facteurs d’initiation de la trad eiF4E.
- Initiation de la traduction sur le codon initiateur avec recrutement de la grande s-u.
Physiologiquement, eiF4E est séquestré par la protéine 4EBP1 lorsqu’il n’y a PAS nécessité de traduction.
Pendant la traduction, la voie de signalisation mTOR va phosphoryler 4EBP1. Cela entraine l’activation de son ubiquitination, donc la dégradation de 4EBP1, et ainsi la libération de eiF4E.
L’initiation de la traduction est donc rendue possible.
➔ L’élongation de la traduction :
L’élongation de la traduction nécessite des facteurs d’élongation comme eEF.
➔ eEF2K peut phosphoryler eEF, ce qui va l’inactiver → pas d’élongation possible dans ce cas-là.
➔ eEF2K est lui-même régulé par la voie suivante : mTOR active l’enzyme S6K, qui phosphoryle et donc inactive l’enzyme eEF2K. Le facteur d’élongation eEF reste sous sa forme active déphosphorylée, et donc l’élongation est possible
➔ Exemple sur le métabolisme du fer :
La régulation a lieu au niveau des RE. Le fer est essentiel à la synthèse de nombreuses protéines telles que l’hémoglobine. Mais un excès de fer peut entrainer des maladies = hémochromatose.
On assiste donc à 2 phénomènes métaboliques en fonction des conditions :
o Entrée du fer dans la cellule quand il est rare : par l’action de la transferrine et de son récepteur.
o Stockage quand excès de fer: par la ferritine (foie et reins). Cage de 24 polypeptides de ferritine pour fixer le fer en quantité.
Les ARNm de la ferritine et du récepteur de la transferrine contiennent des éléments de réponse au fer, ou IRE (iron reponse element). L’IRE est un segment d’ARN capable d’adopter une structure secondaire en tige boucle spécifiques, sur lesquelles vont venir se fixer les IRP (=IRE bindings proteins) comme l’aconitase.
Plusieurs situations :
ARNm de la ferritine : on a des IRE en 5’ de l’ARNm :
o Si on est en présence de beaucoup de fer, les IRP sont inactives, et se replient sur elles même : cela empêche leur fixation sur les IRE de l’ARNm, ce qui permet d’enclencher la traduction de la ferritine. La protéine pourra alors stocker le fer.
o S’il y a moins de fer : les IRP vont se déplier, et se fixer sur IRE. Ceci empêche l’assemblage des ribosomes ainsi que la traduction de la ferritine. Il n’y a pas de stockage.
ARNm de la transferrine : on a des IRE en 3’ de l’ARNm :
o Si beaucoup de fer: IRP inactives → pas de fixation sur IRE → instabilité de l’ARNm de la transferrine qui ne pourra pas être traduit. Le fer ne pourra pas entrer dans la cellule → pas d’accumulation de fer (mais donc un stockage par la ferritine)
o Si moins de fer: IRP vont se déplier → interaction sur IRE → stabilise l’ARNm → accumulation de fer, mais pas de stockage.
III.E. REGULATION POST TRADUCTIONNELLE DE L’ACTIVITE DES PROTEINES :
Plusieurs modes d’action : Les protéines sont synthétisées à partir d’un ARNm. Lors de leur synthèse, elles acquièrent différentes structures (primaires I, secondaires II, tertiaires III, quaternaires IV)
La structure III (après repliement) donne la protéine active. Parfois, on a besoin de contrôler l’activation de cette structure dans le temps et dans l’espace.
Ces modifications sont spécifiques d’AA. On le fait par :
o Liaison ligand récepteur
o Interaction avec d’autres protéines
o Clivage protéolytique
o Modification post traductionnelle
Les modifications post traductionnelles d’une protéine sont réalisées le plus souvent par des enzymes, après la synthèse de la protéine, ou au cours de sa vie dans la cellule. Elle revient à modifier la chaîne latérale des AA, ce qui entraine un changement de fonction de la protéine.
On peut ainsi agir sur une multiplicité de régulation par modification post-traductionnelle comme :
o L’activité enzymatique
o Interaction entre prot -ADN / prot – prot (ex : acétylation des histones)
o La localisation cellulaire (ex : CREB après avoir été phosphorylé -> passage dans le noyau)
o La stabilité de la protéine.
Ces modifications sont très diverses (+ de 100 différentes). Elles sont spécifiques à certains AA : on y trouve par exemple :
o Ajout d’un groupement fonctionnel sur un AA : ex : Acétylation / méthylation / phosphorylation
o Addition de peptides/protéines : ex : ubiquitination, sumoylation.
o Changement de la nature CHIMIQUE des AA : ex : citrullination / desamidation
Phosphorylation : Rôle important de régulateur. Il s’agit d’un ajout d’un groupement phosphate par une enzyme appelée protéine kinase, sur les chaines latérales des AA : S/T/Y. Il y a consommation d’ATP.
C’est un phénomène réversible entre kinase et phosphatase, et largement régulé par les facteurs extérieurs.
Ex : Phosphorylation par PKA de la sérine dans la boite P de CREB
Ex : les hormones de la glycolyse.
Ex : la phosphorylation du domaine C-terminal d’un récepteur entraine le recrutement de la beta-arrestine et provoque l’endocytose du recepteur
L’hydroxylation : HIFIα est un facteur de transcription induit en cas d’hypoxie (absence d’oxygène) pour aider la cellule à s’adapter. Celui-ci est responsable d’une cascade de réactions qui aboutissent au phénomène d’angiogenèse.
Il est constitué d’un domaine de transactivation, et d’un domaine de liaison à d’ADN. Ces deux domaines sont reliés ensemble par un domaine régulateur, qui va servir à activer ou non le facteur en fonction du taux d’oxygène environnant.
On agit sur la séquence régulatrice en hydroxylant les prolines du domaine.
o En présence d’oxygène : prolyl hydroxylase sont activées → hydroxylation d’une proline et d’une asparagine de HIFAα → induction de sa poly ubiquitination → dégradation par le protéasome
o En absence d’oxygène : pas de substrat disponible pour l’hydroxylation → HIFIα n’est pas dégradé → angiogenèse.
Exemple de la Maladie de Von Hippel-Lindau (VHL):
C’est une maladie génétique rare (1/36 000). Elle désigne l’apparition de tumeurs dans les zones très vascularisées. Elle correspond à la mutation du gène VHL codant pour l’E3 ligase (ou ubiquitine ligase) du facteur de transcription HIF1α.
Normalement:HIF1α est inhibée par l’HIF hydroxylase. En effet, là où il y a le plus d’O² , l’HIF hydroxylase peut hydroxyler sur une proline et une asparagine l’HIF1α.
Grâce à VHL, cette double hydroxylation rend l’HIF1α inactive.
Dans les zones où la concentration en O² est la plus faible (là où c’est le moins vascularisé), l’HIF hydroxylase ne peut pas agir, et HIF1α joue son rôle, permettant à la cellule de survivre avec moins d’O² en initiant une néo-vascularisation.
La maladie rend inutile VHL, ce qui induit une expression maximale de HIF1α même dans les zones vascularisées.
En résumé : VHL code pour l’E3 ligase de HIF1α. L’E3 est muté donc non fonctionnel ce qui empêche le mécanisme de poly ubiquitination et ce malgré l’HIF hydroxylase dans les milieux vascularisés à apparition de tumeurs.
L’acétylation :
o Ajout d’un groupement CO-CH3 à une molécule
o Catalysée par des acétyltransférases
o Pour l’histone H3, les enzymes HAT transfèrent un groupement acetyl sur leurs résidus lysines -> activation de la transcription.
Ce phénomène est réversible par des HDAC.
L’alkylation :
o Ajout/substitution d’un méthyle sur un substrat
o Retrouvé dans le code des histones
La byotinilation :
o Biotine = B7, B8, vitH
o Impliqué dans le métabolisme cellulaire
o Présente en faible quantité dans l’organisme
o Fixation sur des prot, AN..
o Est un Co-facteur de réactions
La glycosylation
o Liaison d'un glucide à une protéine
o Résistance à la protéolyse
L’isoprenylation
o Addition d’un groupement isoprenoïde.
L’ubiquitination : Il s’agit de la fixation d’une petite protéine : l’ubiquitine.
Plusieurs fonctions selon si elle est mono ou poly.
La mono-ubiquitination en jeu dans les processus de signalisation cellulaire, réparation de l’ADN, régulation des marquages épigénétiques de la chromatine ou encore de la localisation de certaines protéines.
• Remodelage de la chromatine (histones) → mono- ubiquitinylation ;
• Régulation de la localisation intracellulaire → mono-ubiquitinylation ;
• Régulation du trafic intracellulaire (GTPase) → mono-ubiquitinylation ;
• Régulation de la signalisation intracellulaire (GTPase) → mono-ubiquitinylation ;
• Réparation de l'ADN (PCNA) → mono-ubiquitinylation.
Ou poly-ubiquitination (au moins 4 ubiquitines) → Rôle important dans le recyclage et la dégradation des protéines. La poly-ubiquitination se fait lorsque plusieurs ubiquitines forment une chaine entre elles, attachée sur les lysines (minoritairement d’une protéine acceptatrice).
Les molécules poly-ubiquitinées vont être détruites dans le protéasome.
Machinerie qui permet la fixation = 3 étapes
1) Elle utilise de l’ATP. Il y a activation d’ubiquitine par E1 : transfert de la molécule d’ubiquitine (Ub) avec formation d’une liaison thioester.
2) Transfert de Ub sur une enzyme E2 : étape dite de transthioésterification.
3) Couplage de Ub à la protéine substrat E3 (ubiquitine ligase), qui est responsable de la fixation de l’Ub sur la protéine cible.
E3 agit comme une plateforme. E3 est spécifique de l’ubiquitination
En résumé : intervention successive de 3 ligases E1, E2, et E3, qui permet l’ajout d’une chaine de polyubiquitine sur la protéine, qui sera reconnue par le protéasome, ce qui entrainera sa dégradation. Ce mécanisme conduit à la poly-ubiquitination.
La polyubiquitination est le phénomène de fixation d’une ubiquitine qui se fixe sur une autre ubiquitine déjà fixée afin de former une chaine d’ubiquitine sur la protéine.
Il s’agit d’un signal de dégradation pour le protéasome = complexe macromoléculaire constitué de:
o Partie 19S : elle reconnait et fixe les molécules d’ubiquitine ce qui entraine la fixation de protéines poly-ubiquitinées.
o Puis la partie 20S (chambre catalytique) qui contient des protéases qui vont couper la chaine peptidique en petits morceaux : la protéine rentre dans la partie 20S
o Protéasome : dégrade les protéines mal repliées en recyclant les AA.
La sumoylation :
Liaison covalente d’une ou plusieurs protéine SUMO sur une lysine acceptatrice d’une protéine cible. C’est un mécanisme similaire à l’ubiquitination, mais ses propriétés sont différentes.
Elle a plusieurs fonctions :
• Interaction ADN-protéine
• Trafic intra cellulaire
• Activité transcriptionnelle
• Antagoniste possible de l’ubiquitine
La cascade enzymatique est similaire à celle de l’ubiquitine. C’est un mécanisme dynamique et réversible, qui fait intervenir 3 enzymes (donc 3 étapes) :
1) Maturation : Clivage de la partie C-ter de la protéine SUMO par des carboxy-hydroxylases, puis exposition de dipeptides de glycine GG de SUMO pour E1.
2) Activation : Création de liaisons thioester entre SUMO-GG et E1 → étape ATP dépendante
3) Conjugaison : Transfert de l’enzyme E1 à E2
La citrullination :
o Désamination de l’arginine en citrulline (qui est un AA non encodé par l’ADN), sous l’action d’une peptidyl-arginine désaminase (PAD)
o Mécanisme dépendant de la concentration en Ca2+, car il est activé en cas de concentration importante de Ca2+ intracellulaire, c’est-à-dire pendant un processus non physiologique (inflammation, nécrose…)
o Processus ayant une importance dans l’apoptose, la kératinisation de la peau, protection neuronale..
o En pathologies:
hypercitrulination retrouvée dans la polyarthrite rhumatoïde, sclérose en plaque, cancers...
Hypocitrullination retrouvée dans le psoriasis → cela nous permet une meilleure compréhension de la pathologie, mais n’a aujourd’hui aucun intérêt dans la thérapeutique (car impossible de cibler citrulline).
Les ponts disulfures
o Liaison covalente par oxydation entre 2 souffres des fonctions thiols de 2 cystéines
o Élément de structure tertiaire ou quaternaire
o Processus spontané en conditions oxydantes (= en présence de dioxygène)
o Stabilité protéique
o Activation enzymatique
Ex : oxydation de la kératine dans les cheveux.
Le clivage protéolytique :
o Clivage protéolytique
Ex : insuline : nécessite des modifications post traductionnelles pour être activée. Elle est synthétisée sous la forme d’une pré-pro-insuline. Suite à sa maturation par une peptidase, on obtient de la proinsuline.
Pro insuline : a besoin d’être coupée en 2 endroits avec élimination du peptide C par une peptidase.
Des ponts disulfures vont relier la chaine A à la chaine B.
Pour qu’elle soit active il y a besoin de ces ponts SS et d’une élimination du peptide C.
Notions à retenir :
L’état chromatinien va être important pour déterminer l’accessibilité ou non des facteurs de transcription à la séquence d’ADN.
Transcription active, Chromatine ouverte, décondensée, acétylation des histones, faible méthylation des ilots Cpg.
Transcription inactive, Chromatine fermée, condensée, histones désacétylés, méthylation des ilots Cpg, histones méthylés.
Mécanismes de l’empreinte génétique (qui est une expression MONO-allélique !)
Bien retenir que la fixation des protéines SR va réguler l’épissage alternatif.