ADN recombinant provient d'une combinaison entre :

• ADN d'un organisme donneur = ADN à cloner
• ADN d'un vecteur = ADN hôte

-> biotechnologies et santé :

• prévention
• diagnostic
• nouveau médicament = bio médicament
• production de protéine recombinantes :
• hormones
• facteur de croissance
• vaccins recombinants
• facteur de coagulation
• anticorps

Clonage

= isoler et obtenir de nombreuses copies identiques d'un gènes ou d'un fragment de gène

-> conservation parfaite de l'info génétique

• à l'échelle cellulaire = clonage cellulaire
• à l'échelle de l'organisme = clonage reproductif

-> clone : grand nombre de cellules ou de molécules identiques et provenant d'un seul ancêtre commun

Principe générale

1-Organisme donneur d'où on extrait le fragment d'ADN d'intérêt

2-Le vecteur qui permet d'amplifier le gène d'intérêt

3-On insert le fragment d'intérêt dans le vecteur pour obtenir un ADN recombinant

4-Amplification de l'ADN et expression de la protéine correspondant à l'ADN si on utilise le bon vecteur

Origine de l'ADN de l'organisme donneur

-> 2 possibilités

• ADN génomique = ADN représentant l'ensemble du génome codant et non codant
• extrait à partir d'une culture cellulaire
• ADN complémentaire = ADN ne contenant que les séquences codants (plus d'introns) des gènes
• ADN obtenu par RT des ARNm

-> ARNm a une queue polyA en 3' qui permet d'utiliser un oligonucléotide

• 1ère étape : hybridation avec l'oligonucléotide complémentaire de la queue polyA
• 2ème : élongation par la reverse transcriptase qui permet d'obtenir un brin d'ADN complémentaire
• 3ème : synthèse du second brin d'ADN complémentaire par une ADN polymérase

-> ARNm est éliminé par un ttt à la RNase

-> synthèse du second brin d'ADNc assuré par une ADN polymérase

= on part de l'ARNm puis on obtient un ADNc dont les séquences non codantes sont éliminés

Amplification du fragment d'ADN d'intérêt

-> besoin de :

• 2 amorces
• 4 dNTP
• Taq polymérase
• ADN à amplifier
• Mg
• Tampon salon
• amplification exponentielle

-> PCR en 3 étapes :

• dénaturation
• hybridation
• élongation

-> amorce dans la zone amplifiée

-> environ 30cycles et à chaque cycle on double la quantité d'ADN l'amplification est exponentielle

-> après 28 cycles on a 2²⁸ molécules d'ADN

-> utilisation de l'électrophorèse en gel d'agarose pour voir si la PCR a fonctionné + BET

-> si la PCR fonctionne = 1 seul bande - les fragments ont la même taille

• on utilise un marqueur de taille en pb

-> clonage repose sur l'insertion d'un fragment d'ADN exogène d'un vecteur = permet ensuite d'exprimer l'ADN dans les cellules hôtes

Présentation d'un vecteur de clonage

-> ADN ne peux pas pénétrer librement dans une cellule = un vecteur est un transporteur permettant l'introduction et la multiplication d'un séquence d'ADN dans une cellule hôte

-> grande diversité

• cosmide
• bactériophage
• chromosomes artificiels de levures (YAC) et de bactéries (BAC)

-> vecteurs utilisés en génie génétique ont souvent une origine naturelle bactérienne mais ont été modifiés

-> différents types

• vecteurs d'amplification
• amplifie l'ADN cloné = nombreuses copies possibles
• vecteurs d'expression
• amplifient l'ADN en se multipliant mais sont capables de transcrire et traduire un ADNc = synthèse de protéine recombinante correspondante

-> vecteur ne se réplique pas seul = il lui faut une cellule hôte

-> à chaque vecteur = un hôte cellulaire

• cellule procaryote
• cellule eucaryote

= hôte cellulaire choisi en fonction des buts initiaux

Propriété d'un vecteur de clonage

-> capacité de réplication autonome dans une cellule hôte donnée

• réplication est bidirectionnelle = on obtient un plasmide fils qui assure une stabilité
• = réplication épisomale indépendante de celle de l'ADN de la cellule hôte pour augmenter la stabilité du système

-> possession d'un site de clonage multiple pour l'insertion d'un fragment d'ADN

• = différents sites uniques de restriction donc les sites ou le vecteur peut être ouvert en utilisant la bonne enzyme de restriction -> manipulable facilement
• permet de choisir une enzyme de restriction pour manipuler facilement le vecteur en l'ouvrant puisqu'un plasmide est circulaire et bicaténaire

-> insertion d'un fragment d'ADN plus ou moins grand à l'intérieur du vecteur influence le choix du vecteur

-> présence fréquente d'un marqueur de sélection

• = gène de résistance à un ATB, marqueur de sélection métabolique qui permet de sélectionner des bactéries

Exemple du plasmide, vecteur d'expression

-> plasmide

• petite molécule extra chromosomique d'ADN
• double brin, circulaire
• entre 2 et 5 kb
• capable de se répliquer indépendamment du chromosome bactérien
• peut être transféré d'une cellule à une autre

Un plasmide adopte différentes conformations

-> forme relâchée : plasmide sous forme circulaire, sans surenroulement

• topoisomérases permettent de passer d'une forme relâchée à super enroulée

-> forme superenroulée : forme intermédiaire

• endonucléase clive le plasmide superenroulée pour donner la forme linéaire

-> forme linéaire : qui a été clivé par une enzyme de restriction

Insertion de l'ADN d'intérêt dans le vecteur

-> en 2 étapes

• digestion enzymatique
• ligation

-> mécanisme d'action des enzymes de restriction

• enzyme de restriction est mise en présence d'ADN double brin
• enzyme de restriction se lie à une séquence spécifique
• coupe les 2 brins d'ADN à des endroits précis
• se libère et l'ADN est fragmenté en 2

-> 2 types de coupures générées

• bouts cohésifs : enzyme ne clive pas au même niveau des 2 brins (Eco R1)
• bouts francs : coupure au même niveau, au milieu des 2 brins d'ADN (Sma 1)

Digestion du fragment d'ADN et du vecteur

-> plasmide bicaténaire circulaire et fragment d'ADN à amplifier (rose)

• on choisit l'enzyme de restriction Eco R1, le plasmide est ouvert par digestion enzymatique
• cette enzyme génère des extrémités cohésives
• en parallèle on coupe le fragment d'ADN d'intérêt avec Eco R1 qui génère également des extrémités cohésives

-> digestion enzymatique : doit se faire dans un tampon adapté à l'enzyme et à la température optimale de l'enzyme, elle dure souvent 2h

-> plasmide ouvert + ADN après digestion enzymatique mais comment insérer dans le vecteur ?

• quand on utilise une enzyme de restriction le fragment d'ADN va pouvoir s'insérer dans 2 sens différent du vecteur

-> la séquence d'ADN peut s'orienter dans 2 sens différents

• se fait au hasard
• peut être gênant si on veut synthétiser la prot recombinante de l'ADN que l'on a cloner mais si on veut amplifier une séquence ça ne pose pas de problème de ne pas maîtriser le sens d'insertion

Problématique

• quand on utilise qu'une seule enzyme de restriction le problème = on ne maîtrise pas le sens d'insertion de ce fragment d'ADN
• = 2 sens d'orientations possibles du fragment d'ADN à l'intérieur du génome ce qui peut être gênant ou non
• pas gênant dans le cas où notre objectif est d'amplifier un fragment d'ADN
• mais gênant quand on veut exprimer une prot dans ce cas car le sens est très important

-> les ajouter aux extrémités de l'ADN à cloner

-> 1ère possibilité :

• = on effectuer une PCR classique mais les amorces ne seront pas les mêmes que d'habitue

= nous aurons d'abord une Amorce S avec une partie s'hybridant sur l'ADN à amplifier et une partie qui ne s'hybride pas

-> de la même manière nous aurons une Amorce AS avec une partie qui s'hybride sur l'ADN à amplifier et une partie qui ne s'hybride pas

= on se retrouve avec notre ADN d'intérêt qui a été amplifié de part et d'autre de nos sites de restriction qui vont permettre d'envisager le clonage

-> clonage possible

-> 2ème possibilité :

• = utilisation de 2 enzymes de restrictions distinctes
• intérêts :
• insertion orientée de l'ADN à cloner dans le vecteur
• limitation de la relégation du vecteur sur lui-même

-> on effectue d'abord une double digestion enzymatique = une seule possibilité d'insertion = on maîtrise complètement le sens d'insertion du vecteur

= on privilégie cette méthode

= lorsqu'il y a deux enzymes de restrictions différentes = une seule possibilité d'insertion du fragment d'ADN dans le vecteur

Ligation du fragment d'ADN dans le vecteur

-> ligase : enzyme capable de former des liaisons covalentes

• en présence d'ATP = formation de liaisons phosphodiester entre 5'P et 3'OH de 2 brins adjacents

-> fragment d'ADN d'intérêt + vecteur + liaisons phosphodiester = plasmide recombiné 

Amplification de l'ADN recombinant

-> faire pénétrer une molécule d'ADN dans une cellule pour laquelle il est étranger = transformation de la cellule hôte -> amplification du vecteur par la machinerie de la cellule hôte

-> avant toute transformation, les bactéries sont rendues compétentes

• leur état physiologique doit garantir une efficacité max de transformation

-> action du chlorure de calcium (CaCl₂)

• ions Ca²⁺ forment des nanopores réversibles dans la membrane bactérienne -> paroi fragilisée -> entrée d'ADN étranger facilitée

Transformation bactérienne

• 1- plasmide + bactéries compétentes
• choc thermique : 90 sec à 42°C -> pour que les plasmides pénètrent dans la bactérie
• ajout du milieu nutritif sans ATB 1h sous 37°C dans un bain thermostaté sous agitation pour exprimer la résistance aux ATB dans la bactérie
• étalement d'une petite partie du milieu des bactéries puis ajout de l'ATB d'intérêt pour ne sélectionner que les bactéries qui ont ingéré le vecteur

-> pourquoi exprimer la résistance plasmidique

• pour ne sélectionner que les bactéries qui ont intégré le vecteur pas recombiné

Sélection des bactéries transformées

-> si on considère qu'une seule colonie = elles auront toutes le même génotype

Amplification du plasmide recombiné

-> ensemencement d'une colonie de bactérie transformée dans le milieu liquide + ATB

-> une nuit à 37°C sous agitation

= multiplication de bactérie et amplification du nombre de plasmide recombiné

-> risque d'utiliser qu'un seul erlenmeyer est d'obtenir un plasmide vide pour éviter cela = conseillé d'en faire 10 en parallèle en faisant 10 erlen et en choisissant plusieurs colonies dans chaque erlen

-> pour bien choisir la colonie il faut repérer celles qui sont grosses et + éloignées les unes entre elles

-> objectif = extraire le plasmide

Extraction du plasmide recombiné

-> bactéries sont lysées par un détergent en milieu alcalin

• libération de l'ADN génomique et plasmidique
• ADN génomique et les protéines sont précipitées par de l'acétate de sodium
• précipité est séparé par centrifugation
• surnageant contient de l'ADN plasmidique
• ADN plas est alors précipité, lavé puis redissout dans un tampon adéquat

-> au début 10 relents puis à ce stade = 8

Vérification de la construction obtenue

-> vérification de l'ADN obtenu

-> pb : bactéries poussent sur le milieu + ATB possèdent un plasmide avec le gène de résistance à l'ATB

• mais ce plasmide contient-il l'insert cloné ?

-> relégation du vecteur sur lui-même possible

Vérification par PCR

-> bactéries transformées peuvent contenir

-> comment distinguer ces 2 populations

• PCR avec les amorces ayant servi à obtenir de l'insert et observation des produits de PCR sur gel d'agarose

Vérification rapide par restriction

-> digestion enzymatique par un enzyme ayant

• un site de R dans l'insert
• un site de R dans le vecteur

-vecteur qui fait 4000pb = on attend une bande à 4000pb

-si on le fait migrer tel quel sans digestion on va obtenir différentes bandes avec différents degrés de surenroulement

= vecteur recombinant sera coupé au niveau de l'insert donc on attend d'obtenir 2 fragments de tailles différentes

Analyse des produits de restriction par électrophorèse sur gel d'agarose

Vérification par séquençage : méthode de Sanger

-> pb : si par ex 1 seul vecteur = une coupure = une bande

• on va re prélever des colonies différentes des premières si possible bien isolées les uns des autres et on recommence le processus

conclusion :

• obtention d'un ADN recombinant amplifié