Critères de choix d'une technique de purification
- Propriétés de la protéine d'intérêt
- Sensibilité (risque de dilution à certaines étapes)
- Spécificité (reconnaître sa protéine dans un lysat cellulaire)
- Disponibilité des réactifs
- Coûts et temps requis
Propriétés des protéines
Masse et poids moléculaires
- Masse moléculaire en Dalton
- Poids moléculaire (masse de la molécule/12ème de la masse d'un atome de Carbone) sans unité
- Densité (masse volumique/masse volumique de l'eau)
Solubilité
- Variable en fonction des protéines (dépend de la taille et de la composition en acides aminés)
Propriétés optiques
- La liaison peptidique absorbe dans l'UV (aromatique : 280 nm)
- Utilisation pour vérifier la pureté des acides nucléiques
Propriétés ioniques
- Point isoélectrique d'une protéine (pI)
- Fonction des groupements de la chaîne latérale
- Charge globale de la protéine (pH<pI ou pH>pI)
Propriété antigéniques
- Une protéine à plusieurs épitopes reconnues par plusieurs clones d'anticorps différents
Extraction des protéines
Lyse cellulaire
- Mécanique (ultrason, choc osmotique)
- Chimique (utilisation d'un tampon de lyse, détergent, agent réducteur, anti-protéase)
- Enzymatique (lyse de la paroi cellulaire de certaines bactéries, levures, plantes)
=> Choix orienté par la nature du tissu/type cellulaire et par les étapes subséquentes de purification
Sédimentation/centrifugation différentielle (en fonction de la densité)
- Sédimentation = processus de séparation au cours duquel les substances contenues dans un milieu se déposent
- La force de centrifuge accélère ce phénomène
Ultrafiltration (en fonction de la m.moléculaire)
- Concentration des protéines dont la masse moléculaire est > à seuil (pression, centrifugation)
Précipitation fractionnée (en fonction de la solubilité)
- Relargage (salting out) par le sulfate d'ammonium (augmentation de la force ionique ce qui diminue la quantité d'eau disponible)
- Variation de pH (minimum de solubilité à un pH proche de son pHi)
Chromatographie exclusion-diffusion/gel filtration
- Séparation selon la taille
- Les petites molécules sont retenues dans les pores de la résine
- Les grosses molécules sont exclues (migration rapide)
Chromatographie échangeuse d'ions
- Séparation selon la charge
- Echangeurs d'anions (porteurs de charges +)
- Echangeurs de cations (porteurs de charges -)
Chromatographie d'affinité
- Séparation selon la spécificité d'interaction d'une protéine avec un ligand
- Le ligand est fixé par covalence à une matrice insoluble
- Liaison réversible entre le ligand et la protéine à purifier
Dosage des protéines totales
- Spectrophotométrie directe (acides aminés aromatiques : Tyr, Trp)
- Méthodes colorimétriques (Gornall, Lowry, BCA, Bradford)
Séparation en fonction de la taille
SDS-Page ( Sodium DodecylSulfate –PolyAcrylamideGel Electrophoresis)
1/ Dénaturation et réduction (le SDS recouvre la surface de la protéine et lui attribue une charge négative uniforme. Cela permet d'éliminer les effets de la charge native de la protéine et de la rendre linéaire, de sorte que la migration dans le gel se fait uniquement en fonction de la taille, et non de la forme ou de la charge)
2/ Séparation par électrophorèse (en raison de la charge négative induite par le SDS, les protéines migrent vers l'anode à une vitesse qui est inversement proportionnelle à leur taille. Les petites protéines traversent plus facilement les pores du gel, tandis que les grandes protéines sont freinées, ce qui permet une séparation des protéines en fonction de leur taille)
Western Blot
1/ SDS-Page
2/ Transfert des protéines sur une membrane (Les protéines séparées sont transférées sur une membrane à l’aide d’un courant électrique, cela permet de rendre les protéines accessibles aux anticorps pour la détection)
3/ Détection
Electrofocalisation
- Migration par électrophorèse avec gradient de pH
Protéomique
Protéome : ensemble des protéines d’une cellule, d’un tissu, d’un organisme à un moment donné dans des conditions données
Protéomique : étude des protéomes
